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蛋白質(zhì)表達(dá)以后，在發(fā)揮真正功能之前，會(huì)經(jīng)過(guò)多種不同的翻譯后修飾，例如，磷酸化，乙酰化，糖基化等基團(tuán)修飾。本文主要講下兩種研究蛋白磷酸化修飾的方法：Western Blot和質(zhì)譜檢測(cè)法。

蛋白質(zhì)翻譯后修飾種類(lèi)

蛋白磷酸化修飾過(guò)程

蛋白磷酸化修飾這一過(guò)程是通過(guò)蛋白激酶催化，將磷酸基團(tuán)從ATP轉(zhuǎn)移到多肽底物的絲氨酸、蘇氨酸，或酪氨酸殘基上。并且磷酸化修飾的過(guò)程是可逆的，去磷酸化反應(yīng)由蛋白磷酸酶催化完成。

蛋白質(zhì)磷酸化修飾反應(yīng)過(guò)程

蛋白磷酸化檢測(cè)方法

目前，蛋白磷酸化的檢測(cè)方法有很多種，本文將著重講解兩種檢測(cè)蛋白磷酸化的方法：Western Blot和質(zhì)譜分析法。

一 、Western Blot檢測(cè)方法

Western Blot是檢測(cè)蛋白磷酸化水平的常用方法，主要過(guò)程為先利用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，隨后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后使用特異性識(shí)別磷酸化蛋白的抗體來(lái)鑒定目標(biāo)蛋白的磷酸化水平。只有被磷酸化修飾的蛋白才會(huì)在相應(yīng)分子質(zhì)量的地方顯現(xiàn)特異性蛋白條帶。

Western Blot實(shí)驗(yàn)過(guò)程

Western Blot蛋白磷酸化檢測(cè)結(jié)果

Western Blot檢測(cè)方法優(yōu)勢(shì)：

1-. WB方法簡(jiǎn)便，多數(shù)實(shí)驗(yàn)室具備Western Blot設(shè)備條件。

2. 許多磷酸化抗體十分靈敏，能夠檢測(cè)低至10ug的蛋白樣品。

3. 對(duì)于豐度低的蛋白，可以先通過(guò)IP使用目標(biāo)蛋白的抗體對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行富集，再進(jìn)行WB檢測(cè)被磷酸化的蛋白，檢測(cè)效率可以提高幾倍甚至幾十倍。

Western Blot檢測(cè)方法缺點(diǎn)：

1-. 特異性磷酸化抗體難以制備，許多特異性位點(diǎn)的磷酸化檢測(cè)受限。

2. 測(cè)定的磷酸化水平受樣品處理和凝膠上樣的誤差影響。

3. 同時(shí)獲取多個(gè)蛋白質(zhì)磷酸化的位點(diǎn)信息會(huì)受限。

二、質(zhì)譜檢測(cè)方法

Western Blot的方法雖然簡(jiǎn)便，但是對(duì)于大規(guī)模分析復(fù)雜的生物樣品的磷酸化水平就不再適用了。而質(zhì)譜卻能很好的解決這一問(wèn)題。依靠高精準(zhǔn)度質(zhì)譜儀，如今快速準(zhǔn)確分析細(xì)胞中高豐度蛋白的磷酸化修飾已是非常簡(jiǎn)單的事。具體的檢測(cè)方法為先通過(guò)SDS-PAGE膠，或者2D-PAGE膠等分離目標(biāo)蛋白，將含有目標(biāo)蛋白的條帶切下，胰酶消化，LC-MS/MS檢測(cè)分析蛋白序列和相應(yīng)位點(diǎn)的磷酸化修飾。這個(gè)方法適用于同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)蛋白的磷酸化水平。此外，對(duì)于磷酸化豐度相對(duì)較低的目標(biāo)蛋白，我們也能采取像下圖中固定化金屬親和層析IMAC等方法來(lái)富集磷酸化的肽段，再使用質(zhì)譜對(duì)富集的蛋白進(jìn)行分析。

磷酸化蛋白富集和質(zhì)譜檢測(cè)

質(zhì)譜檢測(cè)方法優(yōu)勢(shì)：

1-. 精準(zhǔn)度高，能夠同時(shí)檢測(cè)多個(gè)蛋白的多個(gè)磷酸化位點(diǎn)。

2. 適用于大規(guī)模分析蛋白磷酸化水平。

3. 不依賴(lài)于磷酸化抗體。

質(zhì)譜檢測(cè)方法缺點(diǎn)：

1-. 設(shè)備要求較高，通常需要借助專(zhuān)業(yè)質(zhì)譜分析機(jī)構(gòu)。

2. 測(cè)序結(jié)果分析相對(duì)復(fù)雜，需要依賴(lài)專(zhuān)業(yè)分析軟件，以及生物信息技術(shù)平臺(tái)。

在實(shí)際應(yīng)用中，Western Blot與質(zhì)譜分析方法各有各的好，誰(shuí)也無(wú)法完全被另一種方法所替代。所以在選擇測(cè)定磷酸化修飾的時(shí)候還應(yīng)該根據(jù)具體需要來(lái)決定。如果研究的蛋白正好有商業(yè)化的磷酸化抗體，那么lucky you，你可以選擇Western Blot進(jìn)行快速磷酸化測(cè)定研究。但是如果你所研究的蛋白質(zhì)沒(méi)有可用的商業(yè)化磷酸抗體，或是抗體價(jià)效過(guò)低，亦或是需要大規(guī)模地檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)磷酸化蛋白的水平的話，質(zhì)譜檢測(cè)會(huì)是更好地選擇。

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