關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)測(cè)序,質(zhì)譜測(cè)序,肽譜圖,蛋白質(zhì)組學(xué),代謝組學(xué),tmt,抗體測(cè)序,itraq,蛋白質(zhì)譜鑒定,蛋白質(zhì)組學(xué),代謝組學(xué),tmt,抗體測(cè)序,itraq,蛋白質(zhì)譜鑒定,蛋白質(zhì)組學(xué),代謝組學(xué),tmt,抗體測(cè)序,itraq,蛋白質(zhì)譜鑒定"

上期給大家匯總了一些有關(guān)蛋白質(zhì)測(cè)序原理的基礎(chǔ)知識(shí)，這期著重給大家列舉一些蛋白質(zhì)測(cè)序?qū)嶒?yàn)中新手可能想問(wèn)的問(wèn)題，希望對(duì)網(wǎng)接觸蛋白質(zhì)測(cè)序的實(shí)驗(yàn)新手在選擇蛋白質(zhì)測(cè)序方法上有指導(dǎo)性幫助。

1-. 蛋白質(zhì)樣品純度較高，有什么快速的蛋白質(zhì)測(cè)序的方法嗎？

可以通過(guò)鑒定蛋白質(zhì)的肽譜圖（Peptide mass fingerprinting，PMF）達(dá)到快速測(cè)定蛋白質(zhì)測(cè)序的目的。因?yàn)槊總€(gè)蛋白質(zhì)的序列是特異的，經(jīng)過(guò)特定酶切產(chǎn)生的多肽的質(zhì)量也是一定的，因此，可以利用這一特性，通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)酶切后產(chǎn)生的多肽的質(zhì)量圖譜，即測(cè)定蛋白質(zhì)肽譜圖，再與數(shù)據(jù)庫(kù)蛋白質(zhì)酶切的理論肽譜圖進(jìn)行比對(duì)，從而推斷出蛋白質(zhì)的序列。

2. 蛋白質(zhì)肽譜圖鑒定是基于哪項(xiàng)質(zhì)譜技術(shù)？

測(cè)定肽混合物質(zhì)量數(shù)有效的質(zhì)譜儀是MALDI-TOF-MS（基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜，英文名Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry），靈敏度高，譜峰簡(jiǎn)單，每個(gè)譜峰代表一種肽段。MALDI-TOF-MS分析肽混合物時(shí)，能耐受適量的緩沖劑、鹽，而且各個(gè)肽片幾乎都只產(chǎn)生單電荷離子，因此MALDI-TOF成為進(jìn)行分析PMF的s_h_ǒ_u|選方法。

3. 肽譜圖鑒定的優(yōu)缺點(diǎn)？

通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)肽譜圖分析蛋白質(zhì)序列的方法的優(yōu)勢(shì)在于此項(xiàng)技術(shù)只用經(jīng)過(guò)以及質(zhì)譜分析來(lái)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，測(cè)定的速度較快，而且因?yàn)榈鞍踪|(zhì)序列的特異性，肽譜圖法可以推斷出可信度較高的蛋白質(zhì)，也較為精準(zhǔn)。但是由于肽譜圖測(cè)定需要依賴數(shù)據(jù)庫(kù)信息比對(duì)，因此，對(duì)于數(shù)據(jù)庫(kù)不包含的蛋白質(zhì)，肽譜圖不能夠進(jìn)行準(zhǔn)確分析。

4. 準(zhǔn)確度高的蛋白質(zhì)測(cè)序法有哪些？

雖然理論上蛋白質(zhì)酶切產(chǎn)生的肽段圖譜是特定的，但是影響蛋白質(zhì)酶切，以及鑒定肽段質(zhì)量的因素眾多，因此，肽譜圖對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)序來(lái)說(shuō)還是一種比較粗略的測(cè)定方法，更為精準(zhǔn)的蛋白質(zhì)測(cè)定方法包括Edman降解測(cè)序法，串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)序法等。

5. 如果蛋白樣品中含有多個(gè)蛋白質(zhì)，有什么方法可以一次性對(duì)所有蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)序的嗎？

MS/MS質(zhì)譜鑒定可以檢測(cè)一個(gè)蛋白條帶中的多個(gè)蛋白質(zhì)，只需要將蛋白膠切下來(lái)送測(cè)序即可，在這個(gè)過(guò)程中保證切膠使用的刀具是干凈無(wú)污染的，同時(shí)避免切下旁邊的雜蛋白。質(zhì)譜鑒定公司會(huì)對(duì)膠樣中的蛋白質(zhì)進(jìn)行酶切，再測(cè)定肽段序列，然后將肽段序列與已知蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，即可獲知膠樣中蛋白質(zhì)的ID，并推測(cè)出蛋白的序列。

6. Edman降解法能夠?qū)λ械鞍踪|(zhì)進(jìn)行測(cè)序？

Edman降解測(cè)序法的優(yōu)勢(shì)是能夠?qū)ξ粗牡鞍踪|(zhì)進(jìn)行測(cè)序，目前這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)近乎完善，但是Edman也有一定的局限性。例如，Edman講解法測(cè)序不能夠解決蛋白質(zhì)N端環(huán)化、封閉的測(cè)序問(wèn)題，另外被修飾的蛋白質(zhì)不能給出確切的信號(hào)，這些都在一定程度上限制了Edman降解法的廣泛應(yīng)用。

7. 對(duì)未知的蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，如果蛋白質(zhì)的N端有環(huán)化封閉現(xiàn)象，或者N端有未知修飾時(shí)，如何對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行準(zhǔn)確分析呢？

對(duì)于序列未知的蛋白質(zhì)，特別是經(jīng)過(guò)改造后的重組蛋白質(zhì)，體外合成蛋白質(zhì)，以及改造的抗體，或者基因序列未被研究過(guò)的蛋白質(zhì)，這類蛋白質(zhì)的信息往往不包含在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中。要實(shí)現(xiàn)對(duì)這類蛋白質(zhì)序列的準(zhǔn)確分析就必須通過(guò)蛋白質(zhì)從頭測(cè)序的方法。蛋白質(zhì)從頭測(cè)序法是一項(xiàng)基于質(zhì)譜技術(shù)的分析方法。與傳統(tǒng)質(zhì)譜鑒定的方法類似，從頭測(cè)序法也是先將蛋白質(zhì)酶切成小的多肽片段，接著經(jīng)由高效液相色譜對(duì)多肽片段進(jìn)行分離，再依次通過(guò)兩級(jí)質(zhì)譜對(duì)多肽片段序列進(jìn)行測(cè)定。相較于傳統(tǒng)質(zhì)譜測(cè)序，從頭測(cè)序經(jīng)過(guò)精密的算法，保證鑒定的多肽序列，能夠高準(zhǔn)確度推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列，并且能夠不依賴于數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)序列從頭測(cè)定。

8. 如何對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證？

如果一個(gè)蛋白質(zhì)的序列被成功鑒定了，那么Western blot是很好的驗(yàn)證方法。由于Western blot方法的特異性和靈敏度，因此，通過(guò)Western blot驗(yàn)證的蛋白質(zhì)幾乎可以1_0_0_%確定蛋白質(zhì)鑒定的準(zhǔn)確性，排出質(zhì)譜鑒定的假陽(yáng)性?？梢赃x取針對(duì)蛋白質(zhì)上面某一段序列制備的單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)，再將Western blot的結(jié)果與鑒定的蛋白序預(yù)計(jì)分子量進(jìn)行比對(duì)，即可確定蛋白質(zhì)測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性。

9. 已知蛋白質(zhì)序列，如何對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)？

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，即從蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)它的折疊和二級(jí)，三級(jí)和四級(jí)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。目前有兩種常用的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的方法：1. 同源建模法，通過(guò)已知同源或同一家族中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，再對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行推測(cè)；2. 折疊識(shí)別法，通過(guò)總結(jié)已知的蛋白質(zhì)折疊法作為目標(biāo)蛋白質(zhì)折疊的模板，再根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)推測(cè)出匹配的目的蛋白質(zhì)折疊的過(guò)程。

講了這么多實(shí)驗(yàn)新手可能會(huì)關(guān)心的有關(guān)蛋白質(zhì)測(cè)序的問(wèn)題，但是大家實(shí)際遇到的問(wèn)題各有不同，我們?cè)谶@里就挑選一下具體問(wèn)題進(jìn)行回答

1-. Edman降解測(cè)序是否可以測(cè)定含有大概130多個(gè)氨基酸的未知蛋白？

130個(gè)氨基酸序列比較長(zhǎng)，已經(jīng)超出了蛋白質(zhì)Edman測(cè)序的限度，建議使用蛋白從頭測(cè)序（de novo se）對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行測(cè)定。蛋白質(zhì)從頭測(cè)序不需要借助任何蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，可以對(duì)任何蛋白質(zhì)，包括突變、經(jīng)過(guò)生物改造的非天然蛋白質(zhì)等進(jìn)行測(cè)序。

2. 實(shí)驗(yàn)中通過(guò)Western blot鑒定出一種目的蛋白，分子量約29KD，想直接跑單向SDS-PAGE,然后切膠進(jìn)行PMF，是否可行？PMF和Edman降解法那種更好？

使用SDS-PAGE分離，再將蛋白膠切下來(lái)做PMF是完全可行的。但是PMF比對(duì)的是肽譜圖，存在一定的假陽(yáng)性概率，因此對(duì)蛋白純度的要求較高。所以，建議SDS膠跑開(kāi)一些，保證切下來(lái)的蛋白膠不被其他蛋白膠影響，另外，切膠的時(shí)候注意不能被角蛋白等雜蛋白污染。PMF鑒定效率都比N端測(cè)序要更高，價(jià)格也更低。但是蛋白量、蛋白純度足夠高的話，PMF的結(jié)果也是同樣可信的。

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